Analyse des hétéroduplex
Séquençage Massive parallel sequencing
Analyse fragmentaire
Après avoir multiplié l’ADN, nous utilisons différentes méthodes d’analyse selon le type de défaut génique que nous examinons:
- L’analyse des hétéroduplex pour dépister la présence de mutations;
- Le séquençage pour identifier des mutations;
- L’analyse fragmentaire pour dépister des répétitions;
- La PCR en temps réel pour quantifier des défauts géniques;
- La MPLA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ou southern blot pour rendre visibles des délétions ou des duplications.
Ces deux dernières techniques ne requièrent pas de PCR préalable.
L’analyse des hétéroduplex
L’analyse des hétéroduplex s’appuie à nouveau sur la parfaite complémentarité des bases dans le code génétique.
Supposons que dans un certain gène à un endroit spécifique, nous ayons une mutation sur un seul allèle (par exemple un G) tandis que l’autre allèle est normal et a par exemple un A.
Après multiplication via PCR, nous mélangeons les deux sortes de brins, nous les chauffons et les refroidissons. Cela engendre deux types de doubles hélices.
Le premier type s’apparie parfaitement :
- elles sont homoduplex. Il peut s’agir d’appariements normaux (dans notre exemple A-T) ou d’appariements mutants (G-C).
- L’autre type de doubles hélices donne un mésappariement à l’endroit de la mutation. Elles sont hétéroduplex. En effet, on n’obtient pas une paire de bases entre ‘normal’ et 'mutant' parce qu’elles ne sont pas complémentaires (dans notre exemple G-T et A-C).
- Par un échauffement ou l’ajout d’une substance chimique, nous pouvons distinguer les homoduplex des hétéroduplex et ainsi dépister la présence de mutations.
Séquençage
Jusqu’à ce jour, la méthode de séquençage de Sanger est la technique d’analyse gold standard dans le diagnostic génétique.
Elle a aussi été utilisée pour identifier le génome humain dans son entièreté.
Comment fonctionne le séquençage ?
- Les éléments suivants sont réunis dans une éprouvette :
- Produit PCR
- Une seule amorce, c-à-d un court fragment d’ADN complémentaire avec un ordre de lettres connu ;
- Une enzyme polymérase qui peut copier le code ADN ;
- Les bases A, C, G, T, c-à-d un mélange de nucléotides normaux ; et
- Des nucléotides modifiés, fluorescents.
- Ils ne permettent pas d’allongement de la chaîne, d’où ils arrêtent la réaction.
- L’amorce reconnaît un petit morceau d’ADN complémentaire et s’y lie.
- L’enzyme polymérase transcrit le code avec des lettres ‘nageant librement’.
- Au hasard, une lettre fluorescente sera insérée à un certain endroit.
Dès que c’est fait, la transcription s’arrête. - Lors de chacune des millions de copies du fragment d’ADN dans l’éprouvette, la réaction s’arrêtera à un moment différent. Il en résultera ainsi des fragments de longueurs différentes, mais avec chaque fois la dernière lettre fluorescente.
- Des fragments sont ordonnés sur base de leur longueur et séparés dans un polymère.
Les signaux fluorescents (différents pour chacun des quatre nucléotides) sont ensuite captés par le séquenceur. Le code original est ainsi ‘composé’ par l’ordinateur.
Cette technologie permet de dépister en même temps une ou plusieurs mutations dans un seul gène.
Pour de nombreuses maladies génétiques, plusieurs gènes peuvent toutefois être à la base du problème. Une analyse simultanée de différents gènes via le séquençage Sanger prend beaucoup de temps.
Depuis peu, il existe une technologie nettement plus puissante qui permet l’analyse parallèle de plusieurs gènes : la technologie ‘massive parallele sequencing’ (MPS).
Massive parallel sequencing (MPS)
La technique MPS offre la possibilité d’étudier non seulement un gène à la fois, mais aussi différents gènes ensemble. C’est utile lorsqu’une certaine maladie peut être provoquée par différents gènes. Dans ce cas, le MPS peut accélérer le diagnostic génétique en observant au même moment un ensemble de gènes (panel de gènes), ou tous les gènes (exome), voire le génome entier.
Comment fonctionne le Massive Parallel Sequencing?
- Dans la phase préparatoire, une bibliothèque ADN est fabriquée pour chaque échantillon séparément. Au cours de ce processus, les brins entiers d’ADN sont fragmentés en plus petits morceaux et ensuite complétés de cours fragments d’ADN (adaptateurs). Ceux-ci contiennent une séquence de reconnaissance pour l’appareil d’analyse MPS et un code-barre ADN qui identifie chaque petit morceau d’ADN comme étant unique. De cette façon, tous les morceaux d’ADN peuvent être associés au patient correspondant.
- Ensuite, les différents échantillons – chacun avec leur code-barre unique – sont réunis. Si l’analyse se limite à une partie du génome (pour les panels de gènes ou exome), les morceaux d’ADN dignes d’intérêt (ADN cible) sont d’abord retirés du pool via des sondes.
- Ensuite, chaque fragment individuel d’ADN de la bibliothèque d’ADN est multiplié à l’aide de son adaptateur sur une plaque de verre (flowell). Ce processus s’appelle l’amplification ‘clonale’.
- Enfin, on procède à la détermination des séquences où tous les fragments d’ADN (amplifiés) multipliés de la bibliothèque d’ADN sont séquencés à l’aide d’amorces de séquençage, une enzyme polymérase et l’ajout simultané des quatre bases d’ADN fluorescentes (sequencing by synthesis).
Comment se fait l’analyse des données ?
- Les millions de fragments de séquence obtenus sont comparés à une séquence de référence (alignement/mapping).
- Généralement, chaque position ‘cible’ dans l’ADN est séquencé plusieurs fois via cette technologie.
- Des outils de bio-informatique sont nécessaires pour examiner plus amplement et interpréter la quantité gigantesque d’informations libérée.
Analyse fragmentaire
Dans l’analyse fragmentaire, utilisée pour déterminer la longueur des répétitions, nous commençons la PCR par une seule amorce ordinaire et une seule amorce fluorescente. Elle fait en sorte que les produits de PCR obtenus soient fluorescents. Avec le même instrument que pour le séquençage Sanger, nous séparons les fragments PCR obtenus sur base de leur longueur. Si deux allèles ont un nombre différent de répétitions, nous observerons deux produits de PCR de longueur différente.
Cette technique est normalement utilisée pour le diagnostic moléculaire du syndrome du X fragile, la forme la plus fréquente de retard mental lié au sexe. Ici, nous observons la longueur d’un fragment d’ADN situé dans le gène FMR1, qui contient un certain nombre de répétitions des nucléotides CGG. Chez des individus sains, ce nombre est inférieur à 50, tandis que chez un patient souffrant du syndrome du X fragile, il est nettement plus élevé. C’est visible dans la figure par l’agrandissement du fragment d’ADN.