Heteroduplexanalyse Sequencing Massive parallel sequencing Fragmentanalyse Nadat we het DNA vermenigvuldigd hebben, gebruiken we verschillende analysemethoden naargelang van het type gendefect dat we onderzoeken:
- heteroduplexanalyse om de aanwezigheid van mutaties op te sporen;
- sequencing om mutaties te identificeren;
- fragmentanalyse om repeats op te sporen;
- real time PCR om gendefecten te kwantificeren;
- MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) of southern blot om deleties of duplicaties zichtbaar te maken.
Deze beide laatste technieken vereisen geen voorafgaande PCR.
De heteroduplexanalyse
De heteroduplexanalyse maakt opnieuw gebruik van de perfecte complementariteit van basen in de genetische code.
Veronderstel dat we in een bepaald gen op een specifieke plaats een mutatie hebben op één allel (bijvoorbeeld een G) terwijl het andere allel normaal is en bv. een A heeft.
Na vermenigvuldiging via PCR vermengen we beide soorten strengen, verhitten we ze en koelen ze af. Dat levert twee soorten dubbele helixen op:
- de ene soort matcht perfect: ze zijn homoduplex. Dat kan normaal matchen zijn (in ons voorbeeld A-T) of mutant matchen (G-C);
- de andere groep dubbele helixen geeft een mis-match op de plaats van de mutatie. Die zijn heteroduplexen.
Je krijgt immers geen baseparing tussen 'normaal' en 'mutant' omdat ze niet complementair zijn (in ons voorbeeld G-T en A-C). - Door verhitting of toevoeging van een chemische stof kunnen we homo- en heteroduplexen van elkaar onderscheiden en op die manier de aanwezigheid van mutaties opsporen.
Sequencing
De sequencingmethode van Sanger is tot vandaag de gouden standaard analysetechniek in de genetische diagnostiek.
Hij werd ook gebruikt om het volledige humaan genoom in kaart te brengen.
Hoe werkt sequencing?
- In een reageerbuisje worden volgende elementen samengebracht:
- PCR-product
- één primer, d.w.z. een kort complementair DNA-fragment met een gekende lettervolgorde,
- een polymerase-enzym dat de DNA-code kan kopiëren,
- de bouwstenen A, C, G, T, d.w.z. een mix van normale nucleotiden en
- fluorescent gemerkte, gemodificeerde nucleotiden.
Die laten geen ketenverlenging toe waardoor ze de reactie stoppen.
- De primer herkent en bindt zich aan een complementair stukje DNA.
- Het polymerase-enzym schrijft de code verder over met vrij 'rondzwemmende' letters.
- Lukraak zal op een bepaalde plaats een fluorescente letter ingevoegd worden.
Zodra dat gebeurt, stopt het overschrijven. - Bij elk van de miljoenen kopieën van het DNA-fragment in de reageerbuis zal de reactie op een verschillend moment stoppen. Zo zullen fragmenten van verschillende lengte ontstaan waarvan telkens de laatste letter fluorescent is.
- Die fragmenten worden op basis van lengte geordend en gescheiden in een polymeer.
De fluorescente signalen (verschillend voor elk van de vier nucleotiden) worden achtereenvolgens opgevangen door de sequencer. Op die manier wordt de originele code door de computer 'samengesteld'.
Deze technologie laat toe om één of enkele mutatie(s) in één gen gelijktijdig op te sporen.
Voor heel wat genetische aandoeningen kunnen echter meerdere genen aan de basis liggen van het probleem. Simultane analyse van verschillende genen via Sanger sequencing is tijdrovend.
Sinds kort bestaat een veel krachtigere technologie die de parallele analyse van meerdere genen gelijktijdig toelaat: de ‘massive parallele sequencing’ (MPS) technologie.
Massive parallel sequencing’ (MPS)
MPS biedt de mogelijkheid om niet enkel één gen per keer te bestuderen, maar verschillende genen samen. Dat is nuttig wanneer een bepaalde aandoening door verschillende genen veroorzaakt kan worden. In dit geval kan MPS de genetische diagnose versnellen door op hetzelfde moment te kijken naar een set van genen (genenpanel), of naar alle genen (exoom) of zelfs naar het gehele genoom.
Hoe werkt Massive Parallel Sequencing?
- In de voorbereidende fase wordt voor elk staal afzonderlijk een DNA-bibliotheek aangemaakt, waarbij de volledige DNA-strengen tot kleinere stukjes gefragmenteerd worden en vervolgens met specifieke, korte DNA-fragmentjes (adaptoren) aangevuld worden. Deze adaptoren bevatten een herkenningssequentie voor het MPS analysetoestel en een DNA-barcode, die de DNA stukjes uniek identificeert. Op deze manier kunnen alle DNA stukjes aan de overeenstemmende patiënt gekoppeld worden.
- Vervolgens worden de verschillende stalen - elk met hun unieke barcode - samengevoegd (gepoold). Als de analyse zich beperkt tot een deel van het genoom (voor genenpanels of exoom) worden de DNA-stukjes van interesse (target-DNA) eerst via probes uit de pool gevist.
- Nadien wordt elk individueel DNA stukje uit de DNA-bibliotheek met behulp van zijn adaptor op een glazen plaatje (flowcell) vermenigvuldigd. Dit proces noemt men ‘clonale’ amplificatie.
- Finaal wordt overgegaan tot de sequentiebepaling waarbij alle vermenigvuldigde (geamplificeerde) DNA-fragmenten uit de DNA-bibliotheek gesequeneerd worden met behulp van sequencing primers, een polymerase-enzyme en de simultane toevoeging van de vier fluoresent gelabelde DNA-bouwstenen (sequencing by synthesis).
Hoe werkt de data-analyse?
- De miljoenen bekomen sequentiefragmenten worden vergeleken met een referentie sequentie (alignment/mapping).
- Meestal wordt elke 'target'-positie in het DNA via deze technologie meerdere malen gesequeneerd (gecovered).
- Bio-informatica hulpmiddelen zijn nodig om de gigantische hoeveelheid aan informatie die vrijkomt verder te onderzoeken en te interpreteren.
Fragmentanalyse
In de fragmentanalyse, gebruikt om de lengte van repeats te bepalen, starten we de PCR met één gewone en één fluorescent gelabelde primer. Die zorgt ervoor dat de bekomen PCR-producten fluorescent gemerkt zijn. Met hetzelfde instrument als bij Sanger sequencing scheiden we de bekomen PCR-fragmenten op basis van lengte. Als twee allelen een verschillend aantal repeats hebben, zullen we twee PCR-producten van verschillende lengte waarnemen.
Deze techniek wordt onder andere gebruikt voor de moleculaire diagnose van het fragiele-X-syndroom, de meest voorkomende vorm van geslachtsgebonden mentale retardatie. Hierbij bekijken we de lengte van een DNA-fragment gesitueerd in het FMR1-gen, dat een aantal repeats van de nucleotiden CGG bevat. Bij gezonde personen is dat aantal kleiner dan vijftig, bij een fragiele-X-patiënt veel hoger. Dat is zichtbaar in de figuur door vergroting van het DNA-fragment.